Naslovnica Impresum Predgovor Sadržaj Pojmovnik Literatura

 

12.1. GRAĐA STANICE

Na temelju stanične organizacije žive organizme dijelimo u prokariote i eukariote.
Eukarioti imaju pravu jezgru (eu-prava, karyon-jezgra) obavijenu jezgrinom ovojnicom, a u citoplazmi stanice brojne organele s vlastitom membranom; u jezgri se nalazi nekoliko parova kromosoma koji su građeni od DNA i proteina, a jezgra se dijeli mitozom i/ili mejozom.
Prokarioti (pro-prije, karyon-jezgra) su organizmi (stanice) bez prave jezgre. Dijelimo ih na: bakterije ili eubakterije (cijanobakterije, mikoplazme i bakterije; slike 12.1. i 12.2.) i arheje. Prokarioti imaju samo jedan “kromosom”, a to je gola, prstenasta dvolančana molekula DNA; dijele se binarnom diobom nakon replikacije DNA. Sve do 1950. malo se znalo o genetici bakterija, jer je bilo velikih poteškoća u eksperimentalnom radu (uzgoj, križanje, prepoznavanje na temelju fenotipa).

 

 

Slika 12.1. Građa mikoplazme (lijevo) i cijanobakterije (desno).

 

 

Prokarioti – građa stanice

Nakon što su tehničke poteškoće oko uzgoja prevladane, prokarioti su postali neizostavni eksperimentalni objekti u genetici, posebno u molekularnoj genetici (prethodnik je biokemijska genetika). Eksperimenti na bakterijama zaslužni su za otkrivanje strukture i funkcije gena, regulacije ekspresije gena, mutacija, razjašnjavanje genetičkog koda i dr. Danas mikroorganizmi (bakterije i virusi) imaju ključnu ulogu u kloniranju gena i genetičkom inženjerstvu.

Bakterije su mali jednostanični organizmi koje je moguće vidjeti pomoću svjetlosnog i elektronskog mikroskopa. U prirodi ih ima u velikom broju, a pokazuju veliku raznolikost oblika i prilagođene su različitim okolišnim uvjetima. Nastanjuju sve vrste staništa pa čak i one sa ekstremnim uvjetima (prekomjerno zračenje, tlak, slanost itd.).
Stanična struktura bakterija je vrlo jednostavna. Čini ju prstenasta dvolančana molekula DNA (nukleoid), ribosomi, plazmatska membrana, stanična stijenka (ali ne celulozna kao u biljaka) te u nekih bakterija polisaharidna kapsula (Slika 12.2.).
Vrlo su pogodni organizmi za genetička istraživanja: jednostavna građa, kratak životni ciklus (dijele se svakih 30-40 minuta), jednostavan uzgoj u laboratoriju, raznolikost fenotipa (u smislu funkcije).
Bakteriju Escherichia coli, najpopularniji objekt genetičkih istraživanja, otkrio je 1885. Theodor Escherich.

 

 

 

Slika 12.2. Shematski prikaz građe bakterijske stanice (preuzeto s: http://teachernotes.paramus.k12.nj.us/Nolan/CP%20Bio.htm).

 

 

12.2. FENOTIP BAKTERIJA

Oblik bakterijske stanice može biti sferičan (koki), štapićast (bacili; Slika 12.3.a.) ili spiralan (spirili) (Slika 12.3.b.). Neke vrste bakterija poput aktinomiceta nalikuju micelijima gljiva, a nitastog oblika su oblika. Oblik, boja i veličina bakterijske kolonije važna su svojstva (fenotip) vidljiva na krutoj hranjivoj podlozi (agarskoj ploči). Kolonija na agarskoj ploči predstavlja mnoštvo genetički istovjetnih stanica (klon) koje su nastale iz jedne stanice binarnom diobom (Slika 12.4.). U nekih vrsta bakterija stanice su obavijene polisaharidnom kapsulom što kolonije čini glatkima (S-smooth) za razliku od hrapavih (R-rough) kolonija koje stvaraju bakterije bez polisaharidne kapsule. Vidljivo fenotipsko svojstvo je i prisutnost ili odsutnost bičeva na površini stanice (ako su stanice pokretne, kolonije na agarskoj ploči izgledaju rašireno; ako su stanice nepokretne kolonije su točkaste).
Najčešća svojstva koja istražuju bakterijski genetičari uključuju mutacije gena čiji produkti, enzimi, kontroliraju biosintetske putove (biokemijske mutacije) pri čemu dolazi do promjena biokemijskih svojstava poput otpornosti na antibiotike, fage, faktore iz okoliša i dr.

 

Slika 12.4. Raznolikost bakterijskih kolonija na agarskoj ploči.

 

Bakterije su s obzirom na prehrambene potrebe PROTOTROFI ili AUKSOTROFI. PROTOTROFI – divlji tip bakterija koji može rasti na MINIMALNOJ PODLOZI (voda, izvor ugljika; glukoza ili saharoza, mješavina anorganskih soli).
Genske mutacije uzrokuju zastoj u biokemijskim putovima pa tako nastaju mutante koje ne mogu sintetizirati određene supstance kao aminokiseline, nukleotide ili vitamine i stoga se te supstance moraju dodavati u podlogu kako bi bakterije mogle rasti. Mutante koje zahtijevaju različite dodatke minimalnoj podlozi nazivamo AUKSOTROFNIM MUTANTAMA (npr. auksotrofna mutanta za metionin zahtijeva metionin u podlozi: genotip Met-). Auksotrofne mutante mogu rasti na kompletnoj podlozi (sadrži primjerice ekstrakt kvasca) koja sadrži sve supstance potrebne za rast. Auksotrofi mogu rasti i na selektivnim podlogama: to su minimalne podloge (MP) kojima se dodaju supstance koje bakterija ne može sintetizirati.

Tehnika uz pomoć koje se može brzo utvrditi da li je određeni soj bakterije auksotrofan za određeni metabolit je tehnika otiska ili “replica-plating” tehnika (Joshua Lederberg) (Slika 12.5.). Sa glavne ploče (kompletna hranjiva podloga) kolonije se otisnu na selektivne podloge različitog sastava što omogućava saznanje o njihovom genotipu.

 

Slika 12.5. Tehnika otiska.

 

Geni bakterije organizirani su u jednu grupu vezanih gena (haploidni organizmi). “Kromosom” bakterija je prstenasta, gola, dvolančana molekula DNA, duga od 0,6 do 10 Mb (megabaza=106), a nazivamo ga nukleoid (koristi se još termin GENOFOR = genetički materijal prokariota i virusa). Kromosom bakterije E. coli u linearnom i izduženom obliku ima širinu 2,4 nm, a dužinu od 1,6 mm što je 1000x duže od stanice. Veličina genoma je 4,6 milijuna parova baza.
1997. sekvenciran je genom bakterije E. coli soja K12; kompletna sekvenca ima 4288 gena. Oko 90% DNA E. coli kodira za različite proteine (u humanom genomu je to manje od 2%). Do danas je sekvencirano više od 1900 bakterijskih genoma. Svaka kb (1000 pb) bakterijskog kromosoma sadrži jedan gen (za usporedbu u humanom genomu svakih 30 kb nalazi se jedan gen).
Uz bakterijski kromosom u stanici se mogu nalaziti PLAZMIDI, male kružne molekule DNA. Plazmid je nezavisna samoreplicirajuća čestica (po Lederberg-u). Plazmidi se repliciraju neovisno o bakterijskom kromosomu, a svaki plazmid ima mali broj gena koji bakteriji nisu esencijalni, ali mogu biti vrlo korisni (npr. gen za rezistentnost na antibiotik). Najmanji plazmid ima 1000 pb, a najveći nekoliko Mb.

Većina bakterija dijeli se binarnom diobom nakon replikacije DNA (Slika 12.6.). U povoljnim uvjetima bakterije se vrlo brzo razmnožavaju, primjerice bakterija E. coli se u optimalnim uvjetima dijeli svakih 20 minuta; tijekom kultiviranja preko noći (12 sati) iz jedne stanice nastane kolonija od 107 do 108 stanica. U njezinom prirodnom staništu (debelo crijevo sisavaca) to ide još brže.
Zbog nespolnog razmnožavanja sve bakterije u jednoj koloniji nastale iz jedne stanice su genetički istovjetne (klon). Ipak neke se stanice razlikuju zbog mutacija; za određeni gen bakterije E. coli vjerojatnost mutacije je oko 1x10-7 po staničnoj diobi; budući da se u crijevu svakodnevno stvara 2x1010 novih stanica E. coli broj mutanata bit će 2000 (2x1010/1x10-7).
Mutacije su prema tome jedini izvor genetičke varijabilnosti u bakterija na razini jedinke.
Uz mutacije i genetička rekombinacija pridonosi varijabilnosti, ali na razini populacije.

 

Slika 12.6. Binarna dioba.

 

12.3. MEHANIZMI REKOMBINACIJE U BAKTERIJA

Rekombinacija u bakterija je izmjena genetičkog materijala između dvije homologne molekule DNA. Ukoliko se izmjena genetičkog materijala događa između DNA različitih stanica (jedinki) odnosno vrsta govorimo o horizontalnom prijenosu gena. Budući da su bakterije haploidni organizmi (imaju jednu molekulu DNA) moraju u određenom trenutku biti barem djelomično diploidne (parcijalni diploid ili merozigota) kako bi došlo do rekombinacije. Bakterije imaju mehanizme kojima mogu dobiti "ekstra" DNA što im omogućava rekombinaciju. Takva DNA koja je došla izvana može se ugraditi u genom bakterije domaćina pri čemu nastaju rekombinantni potomci.
Genetičku rekombinaciju u bakteriji E. coli prvi su uočili i objasnili Lederberg i Tatum 1946. (Slika 12.7.). Nakon miješanja stanica istoga soja ali različitog genotipa i nasađivanja na minimalnu podlogu na njoj su narasle prototrofne kolonije koje su rekombinante između dva roditeljska genotipa.
Mehanizmi rekombinacije u bakterija su: transformacija, konjugacija i transdukcija (Slika 12.8.).

 

Slika 12.7. Genetička rekombinacija u bakterija
(preuzeto s: http://sgugenetics.pbworks.com/w/page/24710118/Nobel%20Prize-g1).

 

 

Slika 12.8. Mehanizmi rekombinacije u bakterija.

 

12.4. TRANSFORMACIJA

Izmjena genetičke informacije između gole DNA (donor – stanica koja daje) i DNA stanice recipijenta (primatelj). Transformirajući princip otkrio je bakteriolog Griffith 1928. Gola molekula DNA je kompetentna za transformaciju ako je dvolančana i relativno velika. Stanice kompetentne za transformaciju moraju na površini imati protein – faktor kompeticije za koji se veže strana DNA, a vezanje zahtijeva energiju. Bakterije koje nisu prirodno kompetentne možemo tretirati npr. CaCl2 kod niske temperature; tada stanica postaje kompetentna.
Transformacija se uspješno izvodi elektroporacijom – izlaganjem struji visoke voltaže što olakšava unos gole molekule DNA u stanicu.
Prilikom transformacije u stanicu recipijenta ulazi samo jedan lanac dvolančane DNA, te se ugrađuje u genom domaćina uz pomoć dva krosingovera (Slika 12.9.). Preostalu jednolančanu DNA (dio originalnog bakterijskog kromosoma) razgradit će enzimi egzonukleaze. Nakon replikacije i binarne diobe nastaju dvije stanice od kojih je jedna rekombinantna.

 

Slika 12.9. Transformacija.

 

12.5. KONJUGACIJA

Konjugacija je indirektni prijenos genetičkog materijala iz stanice davatelja (donor) u stanicu primatelja (recipijent) tijekom spolnog razmnožavanja (Slika 12.10.). Stanice koje konjugiraju moraju biti različitih tipova parenja što ovisi o prisutnosti F plazmida ili spolnog faktora u citoplazmi. F plazmid nosi gene za stvaranje F pilusa (“sex pili”) neophodnog za konjugaciju i gene za prijenos DNA iz donora u recipijenta. Stanica koja ima slobodan F plazmid je F+ stanica ili DONOR, a stanica koja ga nema je F- stanica ili RECIPIJENT.
Uvijek konjugiraju F+ i F- stanice i prilikom toga se F faktor donora replicira i njegova kopija prelazi u F- stanicu preko konjugacijskog mostića. Prilikom takvog prijenosa nema rekombinacije gena.

 

 

Slika 12.10. Prijenos plazmida s genom za rezistenciju konjugacijom.

 

F plazmid se, osim što može biti slobodan u citoplazmi, može ugraditi u bakterijski kromosom i pri tom nastaje Hfr soj (“high frequency of recombination”: 1/105 F+ stanica) (Slika 12.11.). F plazmid ugrađuje se u bakterijski kromosom jednim krosingoverom. Plazmide koji se, osim što mogu biti slobodni, mogu ugraditi u bakterijski genom nazivamo episomima. F plazmid je prvi otkriveni episom.

 

Slika 12.11. Ugradnja F plazmida u bakterijski kromosom.

 

Hfr soj konjugira s F- sojem i pri tome Hfr je donor koji daje kopiju svog kromosoma F- stanici (recipijent). Prijenos ide uvijek u jednom smjeru preko konjugacijskog mostića. Bakterijski kromosom se prenosi kao linearna molekula nakon pucanja na određenom mjestu unutar integriranog F plazmida; stoga preko mostića prvo prelazi jedan dio F plazmida koji za sobom “vuče bakterijski kromosom” (Slika 12.12.). Pri tome odmah započinje replikacija kromosoma.
Vrlo rijetko tijekom konjugacije uspije prijeći čitav bakterijski kromosom; ako se to dogodi posljednji u recipijenta ulazi drugi dio plazmida (1/10.000).
Najčešće prijeđe samo dio bakterijskog kromosoma, jer je konjugacijski mostić vrlo nestabilna struktura koja vrlo lako puca. U rekombinaciju je uključen samo dio kromosoma donora koji je ušao u stanicu recipijenta; takva stanica je parcijalni diploid ili merozigota. Rekombinante se mogu detektirati pomoću selektivnih podloga. Selekcija se radi na podlogama sa antibiotikom budući da je F- soj rezistentan, a Hfr osjetljivi soj. Prema tome na podlozi sa antibiotikom narast će samo F- stanice među kojima su rekombinante.

12.6. KARTIRANJE BAKTERIJSKIH GENA

Za kartiranje gena (određivanje položaja i redoslijeda gena) se mogu koristiti svi mehanizmi rekombinacije: transformacija, konjugacija i transdukcija.

Konjugacija i kartiranje

Jacob i Wollman su razvili tehniku prekinutog parenja (konjugacije) kojom su dokazali da je prijenos genetičkog materijala donora u recipijenta za vrijeme konjugacije linearan proces. Pomiješali su sojeve F- i Hfr u mikseru te svakih nekoliko minuta uključivali mikser kako bi razdvojili stanice u konjugaciji. Zatim su stanice nacjepljivali na podlogu koja sadrži antibiotik koji ubija Hfr stanice koje su prirodno osjetljive na njega (Slika 12.12.). Nakon toga su preostale stanice nacijepili na minimalne podloge s različitim dodacima (npr. na podlozi bez leucina može rasti samo prototrofna rekombinanta koja nastaje prijenosom gena za Leu iz Hfr u F- i njegovom ugradnjom u genom F- soja).


Slika 12.12. Prekinuta konjugacija u kartiranju bakterijskih gena.

 

Poredak gena određuje se na osnovu vremena koje je potrebno da određeni gen prijeđe iz donora u recipijenta (prekinuta konjugacija – jedinice: minute) te na osnovu broja prototrofnih rekombinanata koje nastaju prijenosom gena i njihovom ugradnjom u kromosom recipijenta. Karta bakterijskog kromosoma je kružna karta, a jedinice karte su minute koje dobivamo tehnikom prekinute konjugacije (Slika 12.13.).

12. 7. TRANSDUKCIJA

Prijenos nasljedne tvari iz jedne bakterije u drugu pomoću bakterijskih virusa nazivamo transdukcija. Otkrili su je Lederberg i Zinder 1952. (Slika 12.14.): konstruirali su U-cijev čije su strane odvojene filtrom sa veličinom pora manjom od veličine bakterijske stanice; u svakoj strani cijevi bio je jedan auksotrofni soj bakterije Salmonella typhimurium. Iako je između sojeva postojala fizička barijera (filtar) došlo je do rekombinacije i pri tome je nastao prototrofan soj koji je rastao na minimalnoj podlozi. Mogućnost transformacije je isključena jer su podlozi dodali enzime koji razgrađuju golu DNA. U podlozi su međutim našli čestice virusa P22 koji je dovoljno malen da prođe kroz pore bakterijskog filtra i koji je prenio genetički materijal iz jedne bakterije u drugu.

 

12.8. SAŽETAK