Naslovnica Impresum Predgovor Sadržaj Pojmovnik Literatura

 

Mutacija je termin koji je prvi koristio De Vries; to je iznenadna (nasljedna) promjena genetičkog materijala. Evolucijski napredak vrste ovisi o povremenoj sposobnosti gena da mutiraju. Sve nasljedne varijabilnosti u živih bića, i dobre i loše, imaju izvor u mutacijama genetičkog materijala.
Genske ili točkaste mutacije nastaju u somatskim i generativnim stanicama; somatske mutacije uzrokuju bolesti (npr. tumore; slika 14.1.), mozaicizam vidljiv u fenotipu: npr. mozaičnost šarenice oka, šarolikost listova i cvjetova. Mutantni aleli su najčešće recesivni, jer je većina alela divljeg tipa selekcionirana kao dominantna.

 

Slika 14.1. Somatska mutacija u genu stanica tkiva dojke uzrokuje rak dojke.

 

Genske mutacije mogu biti vrlo štetne, mnoge su letalne. Razlog je taj što geni utječu na ekspresiju različitih svojstava preko biokemijskih procesa.
Mutacije su najčešće recesivne jer je u heterozigota prisutan i normalni alel gena, pa je mutirani alel sakriven iza funkcije normalnoga. Mutacije nastaju spontano ili su inducirane.
Spontane mutacije najčešće nastaju zbog grešaka u replikaciji DNA (primjerice zbog tautomerne promjene baza). Primjerice tautomerni imino oblik baze citozina sparuje se s adeninom što nakon replikacije rezultira mutacijom (par CG zamijenjen parom AT) (Slika 14.2.a-c), a inducirane mutacije nastaju djelovanjem fizikalnih i kemijskih mutagena.

 

 

Slika 14.2.a. Normalni i tautomerni oblici baza.

 

 

Slika 14.2.b.Sparivanje tautomernih oblika adenina: amino oblik sparuje se sa timinom; imino oblik sparuje se sa citozinom.

 

 

14.1. MOLEKULARNA OSNOVA I VRSTE MUTACIJA


Spontane i inducirane mutacije imaju istu molekularnu osnovu: mogu nastati supstitucijom, insercijom ili delecijom nukleotida.

Supstitucija je zamjena jednog nukleotida i njegovog para u komplementarnom lancu. Dijelimo je na tranziciju (zamjena jednog para purin-pirimidin drugim parom purin-pirimidin) i transverziju (zamjena para purin-pirimidin parom pirimidin-purin). Zamjena trećeg slova koda (odnosno kodona) najčešće nema utjecaja na strukturu (redoslijed aminokiselina) polipeptidnog lanca pa takvu mutaciju još nazivamo istovjetna ili tiha. Ukoliko pak dođe do zamjene prvog ili drugog slova koda (odnosno kodona) posljedice za organizam su vrlo ozbiljne jer nastaju pogrešne mutacije (zamjena aminokiselina, odnosno promjena strukture i funkcije proteina) i besmislene mutacije (prestanak biosinteze proteina). Primjerice pogrešna mutacija u genu za sintezu beta hemoglobina uzrokuje tešku nasljednu bolest srpastu anemiju (Slika 14.3.).

Posljedica supstitucije je:

  Divlji tip
  mRNA AUG AAG UUU GGC
Protein Met – Lys – Phe – Gly
ISTOVJETNA (TIHA) MUTACIJA mRNA AUG AAG UUU GGU
Protein Met – Lys – Phe – Gly
POGREŠNA MUTACIJA mRNA AUG AAG UUU AGC
Protein Met – Lys – Phe – Ser

BESMISLENA (prerani završetak translacije)
mRNA AUG UAG UUU GGC
Protein Met

 

 

 

Slika 14.3. Pogrešnom mutacijom u genu za beta-hemoglobin dolazi do zamjene aminokiseline Glu aminokiselinom Val što uzrokuje srpastu anemiju.

 

Insercija (adicija) je umetanje jednog ili dva nukleotida; delecija je gubitak jednog ili dva nukleotida. Insercija i delecija uzrokuju FRAME-SHIFT MUTACIJU ili POMAK OKVIRA ČITANJA. Okvir čitanja je način na koji ribosom krećući se po mRNA čita poruku zapisanu u kodonima te ju prevodi u aminokiselinski slijed proteina. Insercijom ili delecijom tri nukleotida ne dolazi do pomaka okvira čitanja.

 

 

Mutacije idu u dva smjera: naprijed (iz normalnog u mutirano: A----a) i natrag (iz mutiranog u normalno, tzv. povratna mutacija; a-----A). Povratne mutacije su rijeđe.
Kada dođe do mutacije u genu, postoji nekoliko putova za opstanak jedinke:

1. Jednostavna povratna mutacija (reverzija) - povratak na staro.

2. Intragenska supresija – unutar jednog gena dolazi do dvije mutacije (adicije i delecije); druga mutacija u istom genu maskira pojavu originalne mutacije; rezultat je dvostruka mutanta koja ima originalni fenotip.

3. Intergenska supresija – povratak funkcije mutiranog gena promjenom drugog gena kojeg nazivamo supresor gen. Supresor geni su najčešće geni za tRNA. Kada mutiraju oni mijenjaju način na koji se čita i prevodi kodon. Npr. tRNA koju stvara nonsense supresor gen čita stop kodon kao kodon za neku aminokiselinu, tako da nema prestanka translacije; postoje najmanje tri supresora za stop kodon UAG u bakterije E. coli.
U genomu postoje i tzv. mutator i antimutator mutacije koje povećavaju ili smanjuju stopu mutacije u stanici; to su najčešće mutacije DNA-polimeraze i to njene egzonukleazne aktivnosti (korekcija krivo sparene baze njezinim izrezivanjem).

14.2. STOPA MUTACIJA ili kako često geni mutiraju

Stopa mutacija je broj mutacija po genu u određenom vremenu, ako se vrijeme mjeri staničnim diobama. Češće se u praksi koristi termin učestalost mutacija – učestalost javljanja određene mutacije u uzorku stanica ili jedinki, a izražava se kao broj mutacija na milijun stanica.
Stopa mutacija jako varira od organizma do organizma, i od gena do gena (Tablice 14.1. i 14.2.). Spontane mutacije su vrlo rijetke (primjerice u humanom genomu 1x1-8 po bazi po generaciji), no ne treba ih podcijeniti jer organizmi imaju tisuće genskih lokusa. Npr. u vinske mušice u jednoj generaciji se mutacija javlja u 5% gameta.
Učestalost mutacija treba gledati i u odnosu na spolni (životni) ciklus (primjerice: vinska mušica – 10 dana; čovjek – 20-30 godina): stopa mutacija u organizama s kratkim životnim ciklusom je veća nego u vrsta s duljim životnim ciklusom.
Stopa mutacija je genetička karakteristika ovisna o životnom ciklusu vrste.

 

Tablica 14.1. Spontana stopa mutacija 8 gena kukuruza.

 

Tablica 14.2. Učestalost spontanih mutacija za gene različitih organizama.

 

14.3. ČIMBENICI KOJI UTJEČU NA STOPU MUTACIJA

  1. Veličina gena – što je gen veći veća je mogućnost za mutaciju.
  2. Genotip – primjerice gen R u kukuruza mutira 3x češće u sorte CORNEL nego u sorte COLUMBIA. Geni mutatori povećavaju stopu mutacija ostalih gena.
  3. Pokretni genetički elementi – transpozoni i retrotranspozoni; zbog mogućnosti mijenjanja mjesta mogu se ubacivati unutar gena te tako izazvati mutaciju.
  4. Temperatura – primjerice povišena temperatura (27 °C) u vinske mušice povećava stopu mutacija 2-3x u odnosu na optimalnu temperaturu (17 °C).
  5. Starenje
  6. Mutageni – čimbenici iz okoliša: zračenja i kemijske supstance induciraju mutacije čija je stopa viša od stope spontanih mutacija. Zračenje primjerice štetnije utječe na stanice koje se aktivno dijele jer su njihovi kromosomi kondenzirani (npr. stanice koštane srži ili tumorske stanice).


14.4. DETEKCIJA MUTACIJA

Mutacije u haploidnom organizmu lako se otkrivaju jer su sve (i dominantne i recesivne) izražene u fenotipu. Za detekciju mutacija u bakterija vrlo je djelotvorna tehnika otiska ili “replica plating” tehnika (Slika 14.4.).

 

Slika 14.4. “Replica plating” tehnika za detekciju otpornosti na antibiotike u bakterija.

 

 

U diploida će se dominantna mutacija u gameti pojaviti u fenotipu potomstva, dok recesivna mutacija neće biti vidljiva u prvoj generaciji (ukoliko nije spolno-vezana).

Bakterijskim testovima može se detektiratii mutageni potencijal neke kemikalije. Najpoznatiji i najčešće upotrebljavani test je AMES-ov test (Bruce Ames, 1973.). Bakterijski testovi razlikuju karcinogene od nekarcinogena s vrlo velikom točnošću (oko 90%), ekonomičniji su od testova na životinjama, daju rezultate u kratkom periodu (2 dana), mogu otkriti slabe karcinogene.
Kada se supstanca okarakterizira potencijalnim mutagenom pomoću Ames-testa, njezin mutageni (karcinogeni) potencijal istražuje se dalje na sisavcima.

14.5. AMES-OV TEST

Osnova Ames-ovog testa je utvrđivanje genske mutacije koja se javlja kao odgovor na djelovanje neke supstance. Test koristi bakteriju Salmonella typhimurium koja nosi mutaciju u genu za sintezu histidina, dakle auksotrofa za histidin (his-). His- sojevi nose supstituciju baza (tranzicija ili transverzija) ili frame-shift mutaciju. Sposobnost neke kemikalije da izazove povratnu mutaciju (his- u his+) uzima se kao njen mutageni, odnosno karcinogeni potencijal (Slika 14.5.). His- sojevi nose mutaciju koja uzrokuje defekt u mehanizmu popravka DNA, te mutaciju koja čini stijenku bakterije propusnijom za kemikalije.
Nisu svi mutageni istovremeno i karcinogeni, ali je korelacija vrlo visoka. Ako je neka supstanca mutagena vjerojatnost da je i karcinogena je 90%.
Kako bi rezultati Ames-ovog testa bili primjenjivi i na eukariotske organizme u testu se koristi izolat jetre štakora (tzv. frakcija S9) koji sadrži enzime za biotransformaciju. Naime nisu sve supstance karcinogene, ali neke metaboliziranjem u jetri to postaju. S druge strane neke toksične i potencijalno karcinogene supstance u jetri se detoksificiraju te više nisu opasne za organizam. Enzimi jetre štakora djeluju jednako kao i enzimi jetre čovjeka pretvarajući nekarcinogene supstance u potencijalne karcinogene (ili obrnuto).

 

Slika 14.5. Princip izvođenja Ames-ovog testa.

 

Slika 14.6. prikazuje kvalitativnu verziju Ames-ovog testa: suspenzija his- stanica i mješavina jetrenih enzima štakora (S9 frakcija – supernatant ekstrakta jetre štakora centrifugiran na 9000 g) nasađena je na podlogu bez histidina. Disk filtar papira namočen je s 2-aminofluorenom, poznatim karcinogenom. Kolonije oko diska rezultat su povratne mutacije his- u his+ zbog mutagenog učinka testirane kemikalije. Kolonije na rubovima (daleko od diska) su spontani revertanti.

14.6. INDUCIRANE MUTACIJE

Muller je 1927. ustanovio da X-zrake povećavaju stopu mutacija u vinske mušice, a Stadler je 1928. potvrdio da X-zrake induciraju mutacije u kukuruzu.

MUTAGENI:

ZRAČENJE

  1. Ionizirajuća zračenja – X-zračenje, svemirsko zračenje i zračenja iz različitih radioaktivnih izvora. Uzrokuju lomove u molekuli DNA ili u drugim molekulama (npr. molekula vode) koje postaju reaktivne (slobodni radikali) i oštećuju DNA. To su zračenja kraće valne duljine pa su stoga i prodornija.
  2. Neionizirajuća zračenja – UV-zračenje. To je zračenje manje prodorno od ionizirajućeg i najčešće ne pogađa stanice germinativne linije. UV zračenje uzrokuje pirimidinske dimere u lancu DNA na mjestima gdje su dva pirimidina jedan do drugog. Pirimidinski dimeri narušavaju helikalnu strukturu i narušavaju vezu s komplementarnim bazama.

KEMIJSKI MUTAGENI

Otkriveni su za vrijeme I svjetskog rata; prvi kemijski mutagen korišten kao oružje bio je tzv.“mustard gas” ili Yperite – alkilirajući agens koji djeluje na bazu gvanin – ima zakašnjeli učinak: mutacija ne nastaje u stanici izloženoj mutagenu već u stanicama kćerkama) (Slike 14.7.a. i b.).
Alkilirajući agensi (N-metil-N-nitrozourea, etilmetansulfonat, etiletansulfonat, nitrozogvanidin) mogu promijeniti specifičnost sparivanja baza). Alkilirajući agensi uklanjaju purinske i pirimidinske prstene što uzrokuje gubitak baza (AP mjesta: apurinska i apirimidinska mjesta) (Slika 14.8.); na prazno mjesto može doći bilo koja baza što nakon replikacije uzrokuje mutacije.
Analozi baza su spojevi čije su strukture slične bazama u DNA pa se ugrađuju umjesto njih. Najčešće uzrokuju tranziciju. To su 5-bromouracil – analog pirimidina (Slika 14.9.) ili 2-aminopurin – analog purinu.
Nitritna kiselina (HNO2) uzrokuje deaminaciju G, C i A (Slika 14.10.).
Akridinske boje ugrađuju se između dvije baze u lancu DNA.

 

Slika 14.7.a. U molekuli Yperita dolazi do eliminacije iona klora intramolekularnom nukleofilnom supstitucijom pri čemu nastaje ciklički sulfonijev ion. Ovaj reaktivni intermedijer veže se za bazu gvanin u molekuli DNA.

 

 

 

Slika 14.7.b. “Mustard gas” – alkilirajući agens; uzrokuje eliminaciju baze gvanin; prazno mjesto može ispuniti bilo koja od 4 baze; nakon replikacije dolazi do tranzicije ili transverzije.

 

 

 

Slika 14.8. Djelovanje alkilirajućeg agensa EMS-a.

 

 

 

Slika 14.9. Analazi baza: 5-bromouracil i 2-aminopurin.

 

 

 

Slika 14.10. Nitritna kiselina kao mutagen: uklanja slobodne amino skupine; adenin --- hipoksantin; citozin --- uracil.

 

 

14.7. POPRAVAK DNA

Molekulu DNA svakodnevno oštećuju zračenje, kemijski mutageni, temperatura i drugo (enzimske greške, spontani gubitak baza: dnevno nekoliko tisuća baza u svakoj stanici sisavca). Evolucija nastoji maksimalno reducirati štetni učinak mutacije i stoga su stanice razvile različite mehanizme za popravak oštećene ili krivo replicirane DNA.
Tri su glavna mehanizma popravka: vraćanje na staro (“damage reversal”); ekscizijski popravak (Slika 14.13.) i postreplikacijski popravak.
“Damage reversal” je npr. fotoreaktivacija (Slika 14.11.) ili direktni popravak O6-metilgvanina uz pomoć enzima koji uklanja metilnu skupinu.

 

Slika 14.11. Fotoreaktivacija (vrsta popravka u bakterija) – enzim (fotoliaza) za popravak veže se u tami za timinski dimer; izlaganje plavoj svjetlosti aktivira enzim koji cijepa vezu između timina; DNA segment je popravljen, enzim se oslobađa.

 

U čovjeka mutacije gena za transkripcijske faktore inaktiviraju popravak timinskih dimera uzrokovanih UV-zračenjem te uzrokuju bolest Xeroderma pigmentosum. To je autosomalna recesivna bolest kod koje osobe imaju veliki rizik od nastanka raka kože zbog izrazite osjetljivosti na UV-zračenje (Slika 14.12.).

 


Slika 14.13. a. Ekscizijski popravak: izrezivanjem baze (preuzeto s: http://www.funpecrp.com.br/gmr/year2003/vol1-2/sim0001_full_text.htm
).

 

 


Slika 14.13.b. Ekscizijski popravak: izrezivanjem nukleotida.

 

14.8. SAŽETAK