Naslovnica Impresum Predgovor Sadržaj Pojmovnik Literatura

 

 

15.1. Razlike u građi stanice, DNA i prijenosu informacije: prokarioti – eukarioti

1. Genom bakterije E. coli ima 4,2x106 pb – haploidni genom čovjeka ima tisuću puta više (3x109).
2. Eukariotska DNA je u obliku nukleoproteina, dok kod E. coli to nije slučaj (gola, dvolančana, kružna DNA).
3. Endomembranski sustavi u eukariota – u E. coli vrlo malo.
4. Veličina stanice: E. coli 0,5 – 5x10-6 m – eukarioti 50 – 100x10-6 m
5. mRNA E. coli translatira se odmah po transkripciji; eukariotska mRNA modificira se prije izlaska iz jezgre; transkripcija i translacija u eukariota prostorno i vremenski odvojene.
6. Prokariotske mRNA su policistronske (sadrže transkript više gena); eukariotske su monocistronske.
7. Geni E. coli pripadaju inducibilnim ili represibilnim operonima; u eukariota nema operona.
8. E. coli – jednostanični organizam; eukarioti – većina su mnogostanični, s diferenciranim stanicama.

C – vrijednost = količina DNA po haploidnom kromosomskom setu eukariota.
Složenost nekog organizma nije direktno povezana s količinom DNA – paradoks C-vrijednosti (Slika 15.1.). Primjerice vrste sličnog kariotipa mogu se razlikovati u količini DNA i do 80 puta. Srodne vrste također se mogu razlikovati po količini DNA (npr. vodozemci - količina DNA varira s faktorom 100).
GENOM = ukupan genetički komplement prokariota ili virusa, odnosno haploidni genetički komplement eukariota. Količina DNA po haploidnom genomu ovisi o složenosti morfologije nižih eukariota, dok kod viših eukariota jako varira (Slika 15.1.).

Svaki jednostruki eukariotski kromosom čini jedna dvolančana molekula DNA; u diploidnoj stanici nalazi se određeni broj takvih dvolančanih molekula DNA. Interfazna jezgra može se razgraditi ako se stavi u hipotoničnu otopinu npr. u vodu; prilikom toga se oslobodi kromatin koji pod elektronskim mikroskopom izgleda poput povezanih malih kuglica (“beads on a string”) koje nazivamo nukleosomima.

15.2. GRAĐA EUKARIOTSKOG KROMOSOMA


Nukleosom = osnovna građevna jedinica kromatina (Slika 15.2.); čini ga dvolančana DNA (oko 146 pb) omotana oko oktamera histona koji čine po dvije molekule histona H2A, H2B, H3 i H4. Histoni su bazični proteini bogati aminokiselinama argininom i lizinom. Nukleosomi su međusobno povezani golom dvolančanom DNA – tzv. “linker” DNA (50-75 pb). Histon H1 je povezan s “linker” DNA koja ulazi i izlazi iz nukleosoma.

 

Slika 15.2. Građa nukleosoma.

 

Nukleosomi čine prvu razinu pakiranja molekule DNA u eukariotski kromosom. Budući da je nukleosom širok samo 11 nm, a metafazno kromosomsko vlakno ima promjer od 700 nm, postoji nekoliko razina pakiranja kromosoma (Slika 15.3.a. i b.). 30 nm široko kromatinsko vlakno formira solenoidno vlakno od 300 nm – namatanjem nukleosomalne DNA. Daljnjim namatanjem nastaje metafazno kromosomsko vlakno čiji je promjer 700 (jedna kromatida) odnosno 1400 nm (Slika 15.3.b.).

 

15.3. a. Namatanjem nukleosoma nastaje 30-nm kromatinsko vlakno (preuzeto s: http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/seitz-stefanie-2004-10-20/HTML/chapter1.html).

 

 

 

Slika 15.3.b. Razine pakiranja eukariotskog kromosoma: od gole DNA do metafaznog kromosoma (preuzeto s: http://faculty.uca.edu/johnc/mbi1440.htm).

 

 

Nukleosomi igraju glavnu ulogu u regulaciji ekspresije gena. DNA pakirana s histonima u nukleosome ima nižu stopu transkripcije od DNA bez nukleosoma. Regije DNA koje nisu povezane s histonima u nukleosome nazivamo nukleazna hipersenzitivna mjesta (NHM) – mjesta osjetljiva na razgradnju nukleazama. Imaju važne funkcije u replikaciji i transkripciji. Tu spadaju npr. promotorske regije gena vinske mušice, miša i čovjeka.

Iako neke DNA sekvence ostaju uvijek slobodne od nukleosoma i tako omogućavaju pristup različitim enzimima (DNA-, RNA-polimerazi …), u većini slučajeva se nukleosomi nalaze na promotorima gena i tako sprječavaju transkripciju. Stoga da bi počela transkripcija nekog gena treba doći do REMODELIRANJA KROMATINA. To se događa:

  1. Acetiliranjem ili deacetiliranjem histonskih proteina pri čemu dolazi do inicijacije ili represije transkripcije (acetilacija histona dovodi do slabijeg povezivanja DNA s histonima što čini molekulu DNA dostupnu transkripcijskim faktorima).
  2. Metilacijom baza u molekuli DNA – inaktiviranje gena.

Kada bi se histoni uklonili iz kromosoma ostala bi proteinska struktura koja izgleda poput skele (http://www.cbs.dtu.dk/staff/dave/roanoke/genetics980218.html). Skelu izgrađuju nehistonski proteini. Ovi proteini sudjeluju u replikaciji, popravku i transkripciji.

Nehistonski proteini predstavljaju asortiman od oko 1000 različitih proteina prisutnih u vrlo malim količinama. Velika je varijabilnost nehistonskih proteina između organizama te između staničnih tipova unutar istog organizma. Nehistonski proteini sudjeluju u višem stupnju organizacije kromatina pa imaju važnu ulogu u regulaciji genske ekspresije.

15.3. KROMOSOMSKO PRUGANJE

Tehnike kromosomskog pruganja omogućile su uvid u kromosomsku strukturu. To su:

  1. G-pruganje – bojanje bojom Giemsa (mješavina boja specifičnih za fosfatne skupine DNA). Ako se fiksirani kromatin tretira enzimom tripsinom ili vrućom otopinom soli na kromosomima će nakon bojanja Giemsom biti vidljive G- pruge (konstitutivni heterokromatin u području krakova kromosoma)
  2. C-pruganje - bojanje Giemsom nakon hidrolize s NaOH; C-pruge predstavljaju konstitutivni heterokromatin u području centromera; DNA u tom području je satelitna (GC- bogata); visoko ponavljajuća DNA.
  3. R-pruganje – boja pruge između G-pruga; reverzno pruganje.

Tehnike pruganja kromosoma omogućile su razlikovanje tri vrste kromatina (Tablica 15.2.):

EUKROMATIN – transkripcijski aktivan kromatin
KONSTITUTIVNI HETEROKROMATIN – centromerni, satelitna DNA
INTERKALARNI HETEROKROMATIN – smješten duž krakova kromosoma

FAKULTATIVNI HETEROKROMATIN - inaktivirani kromosom X; spolni kromatin; Barr-ovo tjelešce

 

Tablica 15.2. Vrste kromatina i tehnike koje omogućuju njihovu detekciju u eukariotskim stanicama.

15.4. CENTROMER

Centromer je primarno utanjenje kromosoma važno za kretanje kromosoma tijekom diobe. U području centromera nalazi se kinetohor. To je troslojna laminarna proteinska struktura kojom se kromosom prihvaća za mikrotubule diobenog vretena. Kinetohori viših organizama sadrže osim proteina i molekulu RNA.
Znanje o kinetohorima uglavnom potječe od istraživanja tzv. CEN regije u kromosomima kvasca. CEN regija kvaščevog kromosoma ima promjer od 200 Å što je isto kao i promjer jednog mikrotubula (MT) – dakle jedan MT vezan je za svaki centromer u kvasca tijekom mitoze i mejoze pa ga nazivamo točkasti centromer.
Viši eukarioti imaju veće centromerne regije pa je više MT vezano za centromer.

15.5. TELOMERE

Eukariotski kromosom je linearna struktura čije krajeve nazivamo telomerama.

Telomere imaju specifične funkcije:

  1. Sprječavaju sljepljivanje krajeva kromosoma
  2. Sprječavaju razgradnju kromosoma (egzonukleazama)
  3. Omogućavaju pravilnu replikaciju krajeva kromosoma

Većina do sada izoliranih telomera sadrže ponavljajuće (repetitivne) sekvence: ponavljanja od 5 do 8 baza. U čovjeka se telomerna sekvenca TTAGGG ponavlja 250 do 1000 puta. Telomere kromosoma čovjeka otkrio je R. Moyzis korištenjem specifičnih proba s visoko repetitivnim dijelom humane DNA.
Visoko repetitivna sekvenca = brojne uzastopno ponavljajuće kopije jedne sekvence = satelitna DNA.
Telomerne sekvence su konzervirane i nađene su u svih kralješnjaka te u jednostaničnih eukariota; slične sekvence nađene su u različitih eukariota.

15.6. PONAVLJAJUĆE (REPETITIVNE ) SEKVENCE DNA U EUKARIOTSKOM KROMOSOMU

Procijenjeno je da 98% DNA eukariota ne nosi nikakvu informaciju (nekada su je nazivali otpadom ili “junk” DNA), no istraživanja pokazuju da se u toj DNA nalaze vrlo važne regije koje reguliraju aktivnost gena. DNA je vrlo heterogena molekula i čine ju: jedinstvena DNA sekvenca (neponavljajuća DNA) – strukturni geni; umjereno repetitivna ili umjereno ponavljajuća DNA i visoko repetitivna DNA (satelitna) koja se nalazi primarno u području centromera i telomera.

U umjereno ponavljajuću DNA ubrajamo:

  1. Raspršenu netranskribirajuću DNA (tu spada porodica Alu sekvenci).
  2. Transkribirajuće gene prisutne u mnogo kopija (rRNA geni i geni za histone).
  3. Transkribirajuće gene prisutne u mnogo kopija koje su se vremenom funkcionalno odvojile (porodice globinskih gena, gena za antitijela, gena za kolagen) – nastali su duplikacijom.

Nakon centrifugiranja DNA eukariota u gradijentu gustoće CsCl2 vidljiva je heterogenost molekule DNA koju čine dvije vrpce: glavna i satelitna (Slika 15.4.). Gradijent gustoće jednak je za svu DNA prokariota.

 

Slika 15.4. Centrifugiranje DNA u gradijentu gustoće CsCl2.

 

Heterogenost i repetitivnost DNA može se istraživati uz pomoć tehnike DNA-DNA hibridizacije. Radi se denaturacija DNA pri visokoj temperaturi pri čemu se odvajaju lanci dvostruke zavojnice, sniženjem temperature dolazi do renaturacije te se prati kinetika renaturacije koja se izražava c0t krivuljom (c0 – koncentracija jednolančane DNA u molima po litri, t – vrijeme u sekundama).
U E. coli renaturacija je vrlo spora jer genom čini jedinstvena DNA.

U eukariota je renaturacija različita, pa se DNA može na osnovu kinetike renaturacije diferencirati u tri grupe:

1. Neponavljajuća, jedinstvena DNA.
2. Umjereno ponavljajuća DNA.
3. Visoko ponavljajuća DNA – uzastopna ponavljanja po milijun puta i više; brza renaturacija; satelitna DNA.

U umjereno ponavljajuću DNA ubrajamo:

1. Raspršenu netranskribirajuću DNA (VNTR – variable number tandem repeats)

U sisavaca je velika količina umjereno ponavljajućih sekvenci koje su raspršene u genomu; npr. u genomu čovjeka nalazimo 300.000 kopija sekvence od 300 pb. Tu sekvencu cijepa restrikcijska endonukleaza AluI, pa ju stoga nazivamo porodica Alu sekvenci. Prava uloga Alu sekvenci još nije sasvim jasna. Alu pripada sekvencama SINEs (short interspersed elements).
Postoje i sekvence LINEs (long interspersed elements) – do 7000 pb koje se ponavljaju do 10.000 puta, to su transpozoni.
Pravi broj SINEs i LINEs sekvenci razlikuje se između vrsta, ali i unutar iste vrste postoje razlike.

Mobilni elementi ili transpozoni (“jumping genes”):

Klasa I transpozona - RETROPOZONI i RETROTRANSPOZONI (“copy/paste” mehanizam premještanja). Premještaju se iz jednog mjesta u genomu na drugo uz pomoć RNA intermedijera: DNA → RNA → DNA – uz pomoć enzima REVERZNE TRANSKRIPTAZE.
Klasa II transpozona: DNA transpozoni - premještaju se u obliku DNA,“cut/paste” proces, potreban enzim TRANSPOZAZA (kodirana od strane transpozona).
Klasa III transpozona: Miniature Inverted-repeat Transposable Elements (MITE) –nemaju gen za transpozazu (pronađeni su u genomu čovjeka, riže, jabuke, žabe).

2. Transkribirajući geni prisutni u mnogo kopija

To su ribosomski geni (slika 15.5.; http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/rDNA.html): u genomu čovjeka je 200 kopija glavnih ribosomskih gena (18S, 5,5S i 28S), a 2000 kopija gena za 5S RNA.
Ponekad multiple kopije gena nisu dovoljne pa stanica mora pribjeći amplifikaciji gena (povećanje broja kopija gena). Takav slučaj nalazimo kod vodozemaca; za vrijeme oogeneze u vodozemaca (žaba Xenopus laevis) amplificiraju se geni za rRNA oko 1000 puta tako da se u oociti akumulira 1012 ribosoma. Amplificirana DNA je u obliku malih kružnih ekstrakromosomskih molekula.
U genomu čovjeka postoji 1300 kopija gena za tRNA.
Geni za histone (5) također se javljaju u ponavljajućim nakupinama.

 

Slika 15.5. Organizacija ribosomskih gena u eukariota.

 

3. Transkribirajući geni prisutni u mnogo kopija nastali duplikacijom

Tu spada porodica globinskih gena čovjeka (geni za alfa i beta lanac hemoglobina) koja se nalazi na kromosomima 11 i 16 čovjeka (Slika 15.6.). Ti su geni nastali duplikacijama i mutacijama.

 

Slika 15.6. Porodica globinskih gena čovjeka; alfa i beta (preuzeto s: http://sickle.bwh.harvard.edu/hbsynthesis.html).

 

15.7. SAŽETAK