Naslovnica Impresum Predgovor Sadržaj Pojmovnik Literatura

 

Bez kontrolirane ekspresije gena u bakterija svi bi se proteini stalno sintetizirali i bili bi prisutni u velikoj količini u stanici. U eukariota bi bez kontrolirane ekspresije gena sve stanice bile identične, s istim genskim produktima, dakle ne bi bilo diferencijacije pa stoga niti različitih staničnih tipova niti tkiva.
Većina kontrolnih mehanizama ekspresije gena je negativna (sprječava ekspresiju), a rjeđa je pozitivna kontrola (omogućavanje ekspresije ili pojačavanje aktivnosti).


Kontrola genske ekspresije odvija se na razini:
1. Transkripcije
2. Translacije
3. Funkcije proteina

U prokariota se glavni dio kontrole ekspresije gena odvija na razini transkripcije.

16.1. MODEL OPERONA

Operon čini više susjednih gena pod zajedničkom transkripcijskom kontrolom istog promotora i operatora.
Jedan od najbolje proučenih primjera regulacije ekspresije gena u prokariota je Lac operon (Jacob i Monod, 1961.; 1965. Nobelova nagrada za otkriće).
Lac operon je inducibilni sustav, jer stanica proizvodi enzime za razgradnju šećera LAKTOZE samo ako je taj izvor ugljika prisutan u okolišu (laktoza je induktor). Inducibilni enzimi se sintetiziraju kada je u okolišu prisutan njihov supstrat.

16.2. METABOLIZAM LAKTOZE

E. coli može koristiti laktozu kao izvor energije zahvaljujući genima Lac operona. Geni Lac operona imaju zajedničku regulaciju ekspresije. Laktoza je disaharid, odnosno beta-galaktozid. Nakon cijepanja laktoze na glukozu i galaktozu, bakterija koristi glukozu kao izvor ugljika i energije.
Enzim koji cijepa laktozu na dva monosaharida je beta-galaktozidaza; taj enzim također može pretvarati laktozu u alolaktozu (Slika 16.1.). Sintezu beta-galaktozidaze kodira bakterijski gen lacZ. Kada započne sinteza beta-galaktozidaze (gen je induciran), inducira se sinteza još dva enzima: beta-galaktozid permeaze (kodira gen lacY) i beta-galaktozid acetiltransferaze (gen lacA). Permeaza je potrebna za transport laktoze u stanicu, dok transferaza štiti stanicu od nastanka toksičnih produkata koje stvara beta-galaktozidaza kada djeluje na druge galaktozide (acetiliranjem drugih galaktozida).

 

Slika 16.1. Beta-galaktozidaza cijepa laktozu na galaktozu i glukozu (a) i pretvara laktozu u alolaktozu (b).

 

Lac geni (z, y i a) ne samo da se induciraju zajedno, već su smješteni jedan do drugoga na bakterijskom kromosomu transkribirajući se kao jedna, policistronska mRNA (Slika 16.2.). Indukcija ovih gena zahtijeva aktivnost jednog drugog gena kojega nazivamo gen regulator (lacI). Gen regulator smješten je blizu gena z, y i a, ali njegova je transkripcijska aktivnost neovisna o njima. Kodira represorski protein, koji utječe na ekspresiju gena uključenih u metabolizam laktoze.

 

Slika 16.2. Geni Lac operona transkribiraju se u jednu policistronsku mRNA; aktivnost gena regulira gen regulator (i) smješten uzvodno.

 

OPERATOR

Da bi represorski protein mogao regulirati aktivnost strukturnih gena (z, y i a) mora postojati kontrolni element ili receptorsko mjesto koje se nalazi uzvodno od gena za beta-galaktozidazu. Kontrolni element je zapravo regija koju nazivamo operator ili operatorsko mjesto, a radi se o sekvenci DNA na koju se veže represorski protein. Ako je na operatorskom mjestu vezan represorski protein to spriječava vezanje RNA-polimeraze i početak transkripcije. Ako je operatorsko mjesto slobodno, transkripcija strukturnih gena može započeti.

PROMOTOR

Promotorsko mjesto prepoznaje RNA-polimeraza koja započinje transkripciju strukturnih gena.

U odsustvu laktoze razina beta-galaktozidaze u stanici je minimalna, dok u prisustvu laktoze značajno poraste (1000 puta) jer se inducira prvi strukturni gen lac operona lacZ, a zatim se induciraju i druga dva strukturna gena (Slika 16.3.a.). U odsustvu laktoze represorski protein koči transkripciju lac operona, jer “sjedi” na operatoru i tako onemogućava RNA-polimerazi pristup promotoru (Slika 16.3.b.).

Indukcija lac operona postiže se inaktiviranjem represora, a to se postiže vezanjem alolaktoze (induktor) za represor. Vezanjem alolaktoze za represor dolazi do strukturne promjene represora (alosterički protein) te se smanjuje njegov afinitet za operatorsku regiju DNA oko 1000 puta.

MUTANTE Lac OPERONA

Mutante strukturnih gena operona z-, y- i a- ne proizvode enzime normalne funkcije. Istraživanja parcijalnih diploda za strukturne gene pokazala su da je divlji tip z+, y+, a+ jači od mutanata.

Konstitutivne mutante su mutante kod kojih su sva tri strukturna gena stalno aktivna tj. stalno se sintetiziraju enzimi bez obzira jeli induktor - laktoza prisutna u okoliš:

Defektni represor i- je mutacija gena i čiji produkt ne funkcionira kao normalni represor. To znači da se takav represor ne može vezati na operator i stoga su svi strukturni geni aktivni. Istraživanja parcijalnih diploida u E. coli pokazala su da je divlji tip gena i jači od mutante i-. Postoji još jedna mutacija i gena koja je jača od divljeg tipa. To je super-represor mutanta iS . Super-represor je stalno vezan na operator pa su prema tome trajno inaktivirani svi strukturni geni tj. nema sinteze enzima.

Mutanta operator gena je oc. Radi se o trajno otvorenom ili konstitutivnom operatoru što znači da sinteza enzima stalno ide, bez obzira na laktozu. To je neregulirana, konstitutivna sinteza. Istraživanja parcijalnih diploida za gen o pokazala su da je mutanta oc jača od divljeg tipa o+.

 

16.4. Lac OPERON: POZITIVNA REGULACIJA

Lac operon i neki drugi operoni koji razgrađuju šećere u bakteriji E. coli mogu biti inhibirani prisutnošću glukoze koju E. coli prioritetno razgrađuje. Za to je ključni protein CAP – katabolitički aktivatorski protein te ciklički AMP (adenozin-monofosfat). U odsustvu glukoze cAMP i CAP su u kompleksu koji se veže za CAP mjesto lac promotora, pri tome izaziva zakrivljenje DNA i značajno povećava afinitet RNA-polimeraze za promotor (Slika 16.4.a). U prisustvu glukoze nema cAMP-a (glukoza inhibira enzim adenilciklazu koja katalizira hidrolizu ATP u cAMP), niti cAMP-CAP kompleksa te je transkripcija Lac operona značajno smanjena (Slika 16.4.b.). cAMP-CAP kompleks djeluje kao pozitivna kontrola transkripcije, za razliku od represora koji je uključen u negativnu kontrolu.
Lac operon je prema tome pod dvostrukom kontrolom: negativnom kontrolom represora i pozitivnom kontrolom kompleksa cAMP-CAP.

16.5. Trp OPERON: REPRESIVNI SUSTAV REGULACIJE

Bakterija E. coli sintetizira triptofan iz prekursora u nekoliko koraka, a svaki korak katalizira specifični enzim. Pet gena kodira sintezu pet enzima potrebnih za sintezu triptofana, ti su geni smješteni jedan iza drugoga na DNA i čine Trp operon.

Kada je triptofan prisutan u stanici u suvišku, veže se za represor i aktivira ga. Aktivirani represor veže se za operatorsku regiju i inhibira transkripciju Trp operona (Slika 16.5.a). U ovom slučaju triptofan djeluje kao korepresor.

Ukoliko u stanici nema triptofana, represor je inaktivan te se induciraju svi geni za enzime biosintetskog puta triptofana (Slika 16.5.b.).

16.6. DRUGI TRANSKRIPCIJSKI KONTROLNI SUSTAVI

TRANSKRIPCIJSKI FAKTORI

  1. U faga T4 transkripcija je kontrolirana posebnim transkripcijskim faktorima; rani T4 geni imaju promotore čije prepoznavanje ovisi o kappa faktoru stanice domaćina.
  2. “Heat shock” proteini stvaraju se kao odgovor na povišenu temperaturu u E. coli; ovi proteini štite dalje stanicu od posljedica povišene temperature.

UČINKOVITOST PROMOTORA

  1. Promotorske sekvence različitih gena E. coli se razlikuju; budući da je afinitet RNA-polimeraze različit za različite sekvence stopa inicijacije transkripcije varira.
  2. Učinkovitiji promotori transkribiraju se sa većom stopom, npr. promotor gena I lac operona – promotor divljeg tipa gena stvara samo jednu mRNA po ciklusu, dok mutantne promotorske sekvence stvaraju do 50 mRNA po staničnom ciklusu što znači da je stopa transkripcije kontrolirana efikasnošću promotora za vezanje RNA-polimeraze.

16.7. KONTROLA NA RAZINI TRANSLACIJE

Odnosi se na učinkovitost translacije mRNA. U prokariota je translacijska kontrola slabo izražena jer su mRNA nestabilne i kratkoživuće molekule. Produkti gena operona razlikuju se u količini, naime redoslijed gena operona određuje i količinu produkta (10:5:2 u lac operonu). Što je gen bliži promotoru, prije započinje njegova transkripcija, te produkta toga gena ima više.
Postoji i regulirajuća RNA molekula (antisense RNA) – to je molekula koja je komplementarna 5’ kraju mRNA, pa zbog toga može spriječiti translaciju mRNA.
Treći mehanizam translacijske kontrole odnosi se na efikasnost vezanja mRNA za ribosom, što ovisi u određenoj mjeri o nukleotidnoj sekvenci na 5’ kraju mRNA.
Učestalost korištenja nekih kodona (engl. codon usage), zbog prevelikog genetičkog koda, također može sudjelovati u translacijskoj kontroli proteina budući da se različite tRNA molekule javljaju u različitim količinama u stanici.

16.8. POSTRANSLACIJSKA KONTROLA

Stanica može imati i određenu kontrolu nad funkcioniranjem enzima koji su alosterički proteini. Već je bilo riječi o aktivaciji i deaktivaciji represora lac operona. Druga vrsta kontrole obuhvaća tzv. povratnu ili “feedback” inhibiciju što znači da je krajnji produkt nekog biosintetskog puta ujedno i inhibitor toga puta (trp operon). Zadnja razina kontrole odnosi se na brzinu razgradnje proteina. Predloženo je nekoliko modela razgradnje proteina koji uključuju tzv. pravilo N-kraja i PEST hipotezu.

- Pravilo N-kraja proteina govori o tome da aminokiselina koja se nalazi na amino- ili N-kraju proteina predstavlja signal za enzime koji razgrađuju proteine te tako kontroliraju dužinu njihovog života (primjerice 2 min ako je na N-kraju arginin do preko 20 sati ako je na N- kraju Met, Ser, Ala, Thr, Val, Gly).

- PEST hipoteza: razgradnja proteina ovisi o regiji bogatoj sa četiri ak (prolin, glutaminska kiselina, serin i treonin) – proteini koji imaju takve regije razgrađuju se u manje od dva sata.

 

16.9. SAŽETAK