Naslovnica Impresum Predgovor Sadržaj Pojmovnik Literatura

 

 

Klon = populacija stanica ili organizama koji su genetički identični, a nastali su binarnom diobom (bakterije) ili mitozom iz jedne stanice ili vegetativnim razmnožavanjem zajedničkog pretka. Nespolno razmnožavanje u prirodi je zapravo kloniranje. Mnogobrojni su primjeri kloniranja u prirodi: u npr. prokarioti, praživotinje, jednostanične alge, biljke, čovjek: monozigotni, jednojajčani blizanci (Slika 20.1.).

 

Slika 20.1. Jednojajčani blizanci - genetički identične jedinke.

 

Vegetativno razmnožavanje u biljaka je razmnožavanje pomoću vegetativnih organa koji se odvajaju od roditeljske biljke i iz njih se razvije nova biljka. Vegetativno razmnožavanje povezano je s diobama meristemskih stanica i mogućnošću neograničenog rasta. Potomci vegetativnog razmnožavanja su genetički identični (klonovi).
Primjerice jagode se nespolno razmnožavaju vriježama (Slika 20.2.a.), đurđica – podankom, luk – lukovicama, a kod biljke kalanhoe na rubovima lisne plojke razvijaju nove biljčice koje se nakon odvajanja od majčinske biljke razvijaju u novu biljku (slika 20.2.b.). Iz pojedinih dijelova biljke (stabljika, korijen, list) mogu se razviti (regenerirati) čitave biljke. Na taj se način razmnožavaju ukrasne biljake (npr. afrička ljubica, božićna zvijezda (Slike 20.3. a. i b.) i voćke.


Slika 20.2.a. Jagoda se vegetativno razmnožava vriježama.

 

Slika 20.2.b. Na rubovima lisne plojke vrste kalanhoe razvijaju se nove biljke.

 

Slika 20.3. Vegetativno razmnožavanje reznicama: afrička ljubica (a), božićna zvijezda (b).

 

Posebni načini nespolnog razmnožavanja su apomiksija i partenogeneza. APOMIKSIJA je razvitak sjemenke bez oplodnje, a sjemenka se može razviti iz neoplođene jajne stanice ili iz bilo kojeg diploidnog dijela tučka (maslačak). PARTENOGENEZA je razvoj embrija iz neoplođene jajne stanice; javlja se u nekih zadružnih kukaca (trutovi). Neke životinjske vrste razmnožavaju se partenogenezom samo u nepovoljnim životnim uvjetima, dok se druge isključivo razmnožavaju partenogenezom, pa su sve jedinke ženskog spola – pri tome se nakon mejoze udvostručuje broj kromosoma u jajnoj stanici koja se razvije u zigotu (neke vrste guštera, moljci, oblići itd.).

20.1. KLONIRANJE BILJAKA U LABORATORIJSKIM UVJETIMA

Tehnikama kulture biljnih stanica i tkiva u uvjetima in vitro (uzgoj u staklenim posudama) mnoge biljne vrste mogu se klonirati u laboratoriju. U sterilnim i strogo kontroliranim uvjetima moguće je iz malih dijelova biljke ili čak iz pojedinih biljnih stanica uzgojiti čitavu biljku. Za prvi pokušaj regeneracije mrkve iz diferenciranog tkiva korijena (Slika 20.4.). zaslužan je F.C. Steward 1952. Takve se regenerirane biljčice mogu iz epruvete prenijeti u zemlju. Na taj se način neka majčinska biljka može klonirati u veliki broj genetički identičnih potomaka.
Stewardov pokušaj regeneracije mrkve iz jedne diferencirane stanice je dokaz totipotentnosti biljne stanice. Totipotentnost je zadržavanje embriogenog potencijala diferencirane stanice.

 

Slika 20.4. Regeneracija biljaka mrkve iz diferenciranog tkiva korijena u uvjetima in vitro.

 

20.2. KLONIRANJE ŽIVOTINJA U LABORATORIJSKIM UVJETIMA

Totipotentnost je puno teže pokazati u životinja. Pokusi na vodozemcima (Xenopus levis) (Slika 20.5.) pokazali su da sposobnost razvoja novog organizma prvenstveno ovisi o fazi razvoja stanica koje se koriste kao donori diploidne jezgre. Ako je donor jezgre nediferencirana stanica embrija iz većine će se jajnih stanica s transplantiranom jezgrom razviti punoglavci. Ukoliko se koriste diferencirane stanice punoglavca (npr. stanice crijeva) u manje od 2% slučajeva će doći do razvoja punoglavca. Jezgre stanica rane embrionalne faze razvitka još uvijek su totipotentne, dok je to rijetkost u već diferenciranih stanica. Iako diferencirane stanice imaju identičan genetički materijal kao i embrionalne, očito je da su neki geni nepovratno inaktivirani, te je potrebno poznavati uvjete pod kojima bi se aktivnost gena vratila.

 


Slika 20.5. Presađivanje jezgre u vodozemaca (preuzeto s: http://science.howstuffworks.com/genetic-science/cloning2.htm).

 

Prvi sisavac kloniran iz diferencirane stanice odrasle životinje bila je ovca Dolly. Eksperiment su uspješno izveli škotski znanstvenici s Instituta Roslin, 1996. (Slika 20.6.). Rezultati njihovog rada objavljeni su 1997. u znanstvenom časopisu Nature. Ovca Dolly je eutanazirana 2003. g. zbog bolesti pluća i jakog artritisa.

KLONIRANJE DOLLY:

Donori nasljedne tvari bile su tri vrste diferenciranih stanica:
1. stanice mliječnih žlijezda 6-godišnje ovce u posljednjem tromjesečju trudnoće;
2. stanice fetusa starog 26 dana;
3. stanice embrija starog 9 dana.
Najbolje su rezultate istraživači dobili s jezgrama stanica mliječnih žlijezda: janje Dolly prvi je sisavac kloniran iz diferencirane stanice (1 uspješan rezultat u 277 pokušaja) (Slika 20.7.).
Znanstvenicima je uspjelo reprogramirati genetički materijal već diferencirane somatske stanice te iskoristiti njen embriogeni potencijal za razvitak novog organizma.

 

Slika 20.7. Postupak kloniranja ovce Dolly (preuzeto s: http://www.millerandlevine.com/cloning/dolly-fig-13-13.jpg).

 

 

Do danas je kloniran veliki broj životinjskih vrsta (Slika 20.8.).

 

 

Slika 20.8. Neke klonirane vrste životinja.

 

 

20.3. TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNA ILI GENETIČKO INŽENJERSTVO

Tehnologija rekombinantne DNA predstavlja niz molekularno-genetičkih metoda uz pomoć kojih je moguće mijenjati nasljednu tvar stanice. Razdoblje rekombinantne DNA tehnologije započelo je otkrićem restrikcijskih enzima, 70.-tih godina prošlog stoljeća. 1978. dodijeljena je Nobelova nagrada za fiziologiju i medicinu W. Arberu, H. Smithu i D. Nathansu za njihov rad na otkriću restrikcijskih enzima (endonukleaza). Restrikcijske endonukleaze su enzimi koje bakterija koristi za razgradnju strane DNA (virusne). Enzim prepoznaje određenu nukleotidnu sekvencu (restrikcijsko mjesto) od 4 do 8 nukleotidnih parova, te cijepa na tom mjestu (ili u neposrednoj blizini) dvolančanu DNA.
Poznata su tri tipa restrikcijskih endonukleaza (prema vrsti sekvence koju prepoznaju, prirodi cijepanja DNA i strukturi enzima).

Restrikcijske endonukleaze tipa I i III nisu pogodne za kloniranje gena jer cijepaju DNA na mjestima koja nisu restrikcijska.

Tip II endonukleaze prepoznaje točno određena restrikcijska mjesta. Radi se o obrnuto ponavljajućim sekvencama ili palindromima (čitaju se isto i slijeva i s desna npr. HANNAH; vidi sliku 20.9.). Restrikcijske endonukleaze tipa II nakon cijepanja ostavljaju ljepljive krajeve (npr. BamHI; vidi sliku 20.9.) ili tupe krajeve. DNA stanice domaćina ima ista restrikcijska mjesta, ali su ona zaštićena od vlastitih restrikcijskih enzima jer su metilirana (vidi poglavlje 15).

Restrikcijski enzimi dobivaju ime prema vrsti bakterije i soju iz kojega su izolirani; primjerice BamH1: Bacillus amyloliquefaciens soj H1.

Slika 20.9. Restrikcijske endonukleaze tip II nakon cijepanja ostavljaju ljepljive ili tupe krajeve (preuzeto s: http://www.gbiosciences.com/EducationalProducts/products.aspx?productid=54e8708c-b45a-4574-8b4a-9aa7e859134e&print=true).

 

Tehnologija rekombinantne DNA bazira se na ugradnji stranog gena od posebnog interesa u genom prokariotske ili eukariotske stanice. To se radi uz pomoć plazmida ili faga koje nazivamo vektorima.
Postupak se sastoji od izolacije strane DNA te izrezivanja željenog fragmenta (gena) pomoću restrikcijskih enzima, njihove ugradnje u vektorsku DNA (uz pomoć enzima ligaze) (Slike 20.10.a. i 20.11.). Vektor se ubacuje u stanicu domaćina gdje se umnožava stvarajući mnogobrojne kopije strane DNA. Geni strane DNA koji su ugrađeni u vektor mogu se prepisati i prevesti u željeni polipeptidni produkt (Slika 20.10.b.).
Kao stanica domaćin najčešće se koristi bakterija E. coli u koju se unose vektori sa željenim genima čijom ekspresijom nastaju velike količine proteinskih produkata. Takve genetički promijenjene bakterije koriste se za proizvodnju lijekova (antibiotici), cjepiva i drugih supstancija za liječenje te laboratorijska istraživanja. Također se mogu koristiti za čišćenje okoliša od zagađivača, za obogaćivanje tla, za ubijanje kukaca nametnika, za otkrivanje minskih polja itd.

 

Slika 20.10.a. Ubacivanje stranog gena u plazmidnu DNA – rekombinantna DNA (preuzeto s: http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/mol20.gif).

 

 

 

Slika 20.10.b.Ubacivanje ljudskog gena u plazmidnu DNA; rekombinantni plazmid umnožava se u bakterijskoj stanici te se u određenom trenutku strani gen prepisuje i prevodi u polipeptidni produkt.

 

 

 

Slika 20.11. Stvaranje rekombinantnog plazmida.

 

Prokariotske vektore ili rekombinantne plazmide nazivamo još i hibridni plazmidi, hibridni vektori ili himerični plazmidi. Plazmidi sa tzv. cos mjestima su kozmidi (cos mjesto čini jednolančana DNA od 12 baza, to su kohezivni ili ljepljivi krajevi, takva mjesta ima u svom genomu fag lambda) (Slika 20.12.). Kozmidi se prenose u bakterijsku stanicu uz pomoć bakteriofaga lamda (u glavi faga nalazi se linearna molekula, a kada uđe u domaćina onda postane kružna sljepljivanjem kohezivnih krajeva). Kozmidi dozvoljavaju kloniranje velikih dijelova DNA (do 50 kb) jer se mali kozmidi ne mogu upakirati u glavu faga.

 

Slika 20.12. Kozmid, plazmid sa cos mjestom koji se prenosi u bakteriju preko bakteriofaga lamda.

 

Ponekad u prokariotskoj stanici nije moguće potpuno eksprimirati neke eukariotske gene jer stanica nema enzime za postranskripcijsku i posttranslacijsku modifikaciju; stoga se koriste eukariotski vektori. Stanica kvasca, S. cerevisiae, ima prirodni plazmid oko 2 mm dužine, pa se takav plazmid koristi za unos gena. To se radi na sljedeći način: konstruira se bakterijski plazmid sa CEN (centromer) regijom i izvorom replikacije kvasca i telomernom sekvencom kromosoma kvasca. Tako konstruirani plazmid je YAC (Yeast Artificial Chromosome). YAC može nositi veliki dio strane DNA (250 - 2000 kb i više;to je vrlo pogodno upravo za eukariotske gene) koja se prenosi iz generacije u generaciju u stanici kvasca (Slika 20.13.).
Selekcija hibridnog vektora radi se uz pomoć selektivnih podloga s antibiotikom (Slika 20.14.), jer se koristi svojstvo rezistentnosti (gen za rezistentnost dio je plazmidne DNA).

 

Slika 20.13. E. coli plazmid pBR322 modificiran za kvasce. Ovaj plazmid se može replicirati i u stanici kvasca i u E. coli jer ima oba izvora replikacije te CEN regiju. Ako se linearizira te se na krajeve dodaju telomerne sekvence nastaje umjetno stvoreni kromosom kvasca (YAC) koji se koristi za kloniranje velikih dijelova DNA.

 

 

 

Slika 20.14. Selekcija hibridnog vektora.

 

20.4. ŽIVOTINJSKI VEKTORI

U životinja se kao vektori najčešće koriste tumorski DNA virusi poput SV40 virusa (simian vacuolating virus, prvi puta izoliran u majmuna) koji može transformirati normalne stanice miša, kunića i hrčka u tumorske stanice. Kao i lambda fag i SV40 virion može nositi dio strane DNA koja se ubacuje u životinjsku stanicu.

Strana DNA može se ubaciti u eukariotsku stanicu metodom sličnoj bakterijskoj transformaciji. Taj se postupak naziva transfekcija (vidi transformacija u eukariota – promjena normalne stanice u tumorsku).
Eukariotski organizmi s ugrađenim stranim genima su transgenični organizmi (http://io9.com/5482969/transgenic-mice-could-solve-the-obesity-epidemic) i vrlo su korisni za istraživanje ekspresije stranih gena. 1988. patentiran je prvi transgenični miš koji je podložan nastanku tumora. U laboratoriju su uspješno transfecirani miševi štakorskim genom za hormon rasta, a ovce humanim genom za faktor zgrušavanja krvi (faktor zgrušavanja se izlučuje u mlijeku te ga se nakon pročišćavanja koristi u liječenju). Transfekcija se najčešće radi direktnim ubrizgavanjem strane DNA u oocite ili jedno/dvostanične embrije sisavaca (miševi) – uspješnost transfekcije je 15% (Slika 20.15.). Transfekcija se može raditi i uz pomoć retrovirusa (RNA virusi s genom za reverznu transkriptazu).

20.5. BILJNI VEKTORI

Najbolji način za unošenje stranih gena u biljnu stanicu je prirodni sistem transformacije – indukcija “crown-gall” tumora. Bakterija tla Agrobacterium tumefaciens uzrokuje tumore vrata korijena (“crown-gall”) mnogih dvosupnica (Slika 20.16.). “Crown-gall” tumor čine biljne stanice transformirane plazmidom Ti (tumor inducing) iz bakterije A. tumefaciens (Slika 20.17.). Biljne stanice su transformirane plazmidnom T-DNA (transferred DNA) koja se ugrađuje u kromosom stanice domaćina. Stanice tumora proizvode derivate aminokiselina, opine, koje koriste bakterije. Ovaj sistem je vrlo pogodan za manipulaciju stranim genima u biljnoj stanici.

 

Slika 20.16. "Crown-gall" tumor na stabljici (lijevo); “Crown-gall” bolest na lukovicama vrste Gladiolus sp. (preuzeto iz: Pevalek-Kozlina B. Fiziologija bilja, 2003).

 

 

 

Slika 20.17. Kloniranje gena od interesa u Ti plazmid (preuzeto s: http://academic.kellogg.cc.mi.us/herbrandsonc/bio111/propagation.htm).

 

 

20.6. PRIMJENA REKOMBINANTNE DNA TEHNOLOGIJE (Slika 20.18.)

MEDICINA

 


Slika 20.19. Kloniranje ljudskog gena za inzulin i proizvodnja inzulina u genetički modificiranim bakterijama (preuzeto s: http://publications.nigms.nih.gov/thenewgenetics/chapter2.html).

 

 

 

Slika 20.20. Genska terapija cistične fibroze – ubacivanje zdravog gena u stanice pluća pomoću retrovirusa (preuzeto s:
http://www.biology.ewu.edu/aHerr/Genetics/Bio310/Media/ch3jpegs/GeneTherapy-Targeted.jpg).

 

POLJOPRIVREDA


INDUSTRIJA

 

 

Slika 20.21. Proizvodnja biljaka rezistentnih na herbicid korištenjem prirodnog načina trasformacije pomoću Ti plazmida
(preuzeto s: http://academic.kellogg.cc.mi.us/herbrandsonc/bio111/propagation.htm).

 

KLONIRANJE:

REKOMBINANTNA DNA TEHNOLOGIJA je vrlo korisna i potrebna, ali njena primjena zahtijeva oprez te postavlja mnoga etička pitanja: npr. kloniranje organizama (čovjek?), kloniranje stanica, tkiva i organa u terapijske svrhe.

 

19.10. SAŽETAK